Ген CALR отвечает за синтез белка, называемого кальретикулином. Точная его функция остается в значительной степени неизвестной, но, вероятно, он участвует в обеспечении правильного сворачивания новых белков, поддержании необходимого уровня кальция в клетках и ряде других клеточных функций. Мутации гена CALR связаны с новообразованиями костного мозга, которые вызывают появление избыточного количества клеток крови. Эти заболевания крови в совокупности известны как миелопролиферативные новообразования (МПН).

МПН представляют собой гетерогенную группу заболеваний с разнообразной клинической картиной и множеством морфологических проявлений. В МПН выявлено значительное количество генных мутаций, причем JAK2 и MPL являются основными. Мутация V617F обнаруживается почти в 95% случаев истинной полицитемии (ИП). Однако эта же мутация была обнаружена лишь у 50-60% пациентов с первичным миелофиброзом (ПМФ) и эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ). До сравнительно недавнего времени существовал значительный пробел, включающий множество случаев МПН, не содержащих ни одной из этих мутаций, но недавно он был заполнен открытием мутации кальретикулина (CALR). Мутации гена CALR преимущественно обнаруживаются у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией или первичным миелофиброзом и считаются взаимоисключающими с мутациями JAK2 и MPL.

Мутация гена CALR является второй по распространенности генетической аномалией (после мутаций гена JAK2), связанной с ЭТ или ПМФ. Она присутствуют примерно у 20-25% взрослых с ЭТ и у 25-30% взрослых с ПМФ. Хотя у детей они встречаются редко и недостаточно изучены, мутации гена CALR были обнаружены у 50% детей с ПМФ.

Ген CALR расположен на коротком плече хромосомы 19. Его мутация вызвана добавлением или удалением небольшого количества генетического материала в области гена, называемой экзоном 9. Это приводит к образованию аномального белка кальретикулина.

Помимо помощи в диагностике миелопролиферативных новообразований, тестирование на мутацию гена CALR может предоставить информацию о прогнозе заболевания. Исследования показали, что по сравнению с пациентами с мутацией гена JAK2, у людей с мутацией CALR наблюдалось более легкое течение заболевания, меньше признаков и симптомов тромбообразования (тромботических эпизодов) и лучшая выживаемость.

Показания для анализа

Обследование на генетические аномалии, связанные с миелопролиферативными новообразованиями, обычно проводится в рамках последующего наблюдения, если у пациента наблюдается значительное повышение уровня гемоглобина, гематокрита, количества эритроцитов и/или тромбоцитов, или если результаты анализа мазка крови указывают на миелофиброз, наряду с клиническими признаками и симптомами, указывающими на МПН.

Тест на мутацию гена CALR может быть назначен наряду с другими тестами, если врач подозревает у пациента миелопролиферативное новообразование (МПН), такое как эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) или первичный миелофиброз (ПМФ). Как правило, этот тест проводится после того, как у пациента с подозрением на МПН тест на мутацию генов BCR-ABL1 и JAK2 дал отрицательный результат.

Иногда у людей с МПН симптомы могут отсутствовать или проявляться в виде нескольких относительно легких признаков, которые могут сохраняться годами. Однако врач может заподозрить МПН и назначить анализы, если у человека наблюдаются отклонения от нормы в общем анализе крови (ОАК) в сочетании с несколькими признаками и симптомами, такими как:

• Увеличение селезенки (спленомегалия) или печени (гепатомегалия), боли в животе.
• Чрезмерное свертывание крови (например, образование тромба в вене или артерии).
• Легкое образование синяков или кровотечение.
• Головная боль, головокружение, проблемы со зрением
• Признаки и симптомы, связанные с анемией, такие как усталость и слабость.

Подготовка к исследованию

Специальной подготовки к проведению данного анализа не требуется.

Нормы и расшифровка результатов анализа определение мутаций 9 экзона гена CALR

Положительный результат анализа на мутацию гена CALR означает, что у пациента, вероятно, имеется миелопролиферативное новообразование, а именно эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) или первичный миелофиброз (ПМФ).

Примерно у 20-25% взрослых с эссенциальной тромбоцитемией и у 25-30% взрослых с первичным миелофиброзом обнаруживается мутация гена CALR. Эта мутация также редко встречается у людей с хроническим миеломоноцитарным лейкозом, острым миелоидным лейкозом, миелодиспластическим синдромом и хроническим миелоидным лейкозом.

Отрицательный результат обычно означает, что тестируемая мутация CALR не была обнаружена. Однако он не исключает возможности наличия миелопролиферативного заболевания. В 10-15% случаев эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза отсутствуют общие генетические аномалии, то есть отсутствуют мутации генов JAK2, CALR и MPL (так называемые «тройно-негативные МПЗ»).

Нужно ли анализировать весь экзон или достаточно определенных участков?

При молекулярной диагностике мутаций 9 экзона гена CALR принципиально важно анализировать не отдельные заранее выбранные позиции, а весь экзон целиком. Это связано с тем, что мутации в CALR характеризуются высокой гетерогенностью и представлены в основном различными вставками и делециями (indel-мутациями), которые могут иметь разную длину и располагаться в разных участках 9 экзона.

Наиболее частыми являются так называемые мутации типа 1 (52-п.н. делеция) и типа 2 (5-п.н. вставка), однако помимо них описано множество редких и атипичных вариантов, которые не ограничиваются строго определёнными «горячими точками».

Анализ только отдельных фрагментов или типичных мутаций может привести к ложноотрицательному результату и пропуску клинически значимых редких вариантов.

Можно ли использовать CALR для дифференциальной диагностики между реактивным тромбоцитозом и ЭТ?

Мутации CALR являются клональными маркерами миелопролиферативных новообразований и практически не встречаются при реактивных состояниях, таких как воспаление, инфекции, кровопотери, дефицит железа или после хирургических вмешательств. Выявление мутации CALR при повышенном уровне тромбоцитов свидетельствует в пользу клональной природы тромбоцитоза и поддерживает диагноз ЭТ, особенно у пациентов с отрицательным статусом по JAK2 V617F. В то же время отсутствие мутаций CALR не исключает ЭТ, так как часть пациентов может иметь мутации в других генах (например, MPL) или быть так называемыми «тройными негативными» (JAK2-, CALR-, MPL-).

Какова чувствительность методов для определения исследования?

При применении фрагментного анализа ПЦР и секвенирования по Сэнгеру чувствительность обычно составляет около 5-10%, то есть мутация надежно определяется, если мутантный клон представлен не менее чем у 5-10% клеток.

Возможны ли ложноположительные/ложноотрицательные результаты при анализе?

Ложноотрицательные результаты могут возникать при низкой доле мутантного клона ниже порога чувствительности метода, при неполном покрытии 9 экзона, а также при деградации ДНК или наличии ПЦР-ингибиторов в образце.

Ложноположительные результаты встречаются редко и обычно связаны с контаминацией образцов, техническими артефактами ПЦР или ошибками интерпретации при низкоуровневых сигналах. Для минимизации таких рисков используются внутренние контроли, повторные измерения и подтверждение результатов альтернативным методом при сомнительных данных.

Какие методы используются для выявления мутаций в 9 экзоне CALR?

Наиболее распространёнными являются ПЦР с последующим фрагментным анализом, который позволяет выявлять инсерции и делеции по изменению длины ампликона, и секвенирование по Сэнгеру, обеспечивающее прямую визуализацию нуклеотидной последовательности и идентификацию конкретного варианта мутации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Tefferi A, Lasho TL, Finke C. Type 1 vs type 2 calreticulin mutations in primary myelofibrosis: differences in phenotype and prognostic impact. Leukemia. 2014;28:1568–1570.
2. Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитопения, первичный миелофиброз). Российское Национальное гематологическое общество. 2018.
3. Roy S, Manipadam MT, Balasubramanian P. Calreticulin Immunohistochemistry in Myeloproliferative Neoplasms - Evolution of a New Cost-Effective Diagnostic Tool: A Retrospective Study with Histological and Molecular Correlation. Turk Patoloji Derg. 2022;38(1):25-33.
4. Кесаева Л. А., Буланов А. Ю., Финашутина Ю. П. и др. Сравнение молекулярно-генетических методов выявления мутаций в гене CALR при миелопролиферативных заболеваниях. Успехи молекулярной онкологии 2019;6(2):48–54.
5. Субботина Т.Н., Карнюшка А.А., Дунаева E.A., Миронов К.О., Васильев Е.В., Михалев М.А., Смелянская М.Г., Хазиева А.С., Гаркуша Т.A., Хоржевский В.А. Скрининговый анализ мутаций в 9 экзоне гена CALRС использованием метода гетеродуплексного анализа // Вестник гематологии, 2 т.15, 2019 года.